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Wissen, was drin ist.

Newsletter

März 2016

•  U.S. FDA-Inspektion bei Phytos
•  Bestimmung von Aminosäuren
•  Massenspektrometrische Analysen
•  Weiterentwicklung der SimPlate Methode

 

Liebe Leserinnen & Leser,

herzlich willkommen zu unserem ersten Newsletter für den Geschäftsbereich Pharma der GBA Laborgruppe, der für Sie nun regelmäßig, zunächst drei Mal pro Jahr, erscheinen wird.
In dieser Ausgabe erhalten Sie Einblicke in die Methodik bei der Bestimmung von Aminosäuren. Außerdem be­richten wir über massenspektrometrische Verfahren bei der Untersuchung von pharmazeutischen Wirkstoffen.

Viel Spaß beim Lesen!
Ihre GBA Laborgruppe

Wenn Sie regelmäßig an aktuellen und interessanten Themen rund um Analysedienstleistungen in den Bereichen Lebensmittel und Pharma interessiert sind, melden Sie sich zu unserem Newsletter an und klicken

 
 

U.S. FDA-Inspektion der GBA Laborgruppe am Standort der Phytos in Neu-Ulm

von Stefan Woidich, GBA Laborgruppe

Am 28. und 29. Januar 2016 wurde bei der Phytos Labor für Analytik von Arzneimitteln GmbH & Co. KG in Neu-Ulm erneut das Qualitätsmanagement-System durch die U.S. FDA (United States Food and Drug Administration) inspiziert. Die Inspektion war als komplettes Systemaudit für die im Unter­nehmen bestehenden Prozesse zur Umsetzung der cGMP Anforderungen vorgesehen.

Neben der intensiven Kontrolle unserer mikrobiologischen Abteilung lag das Hauptaugenmerk der Inspektoren auf den Prozessen des Abweichungsma­nagements sowie der CAPA (corrective and preventive action), der Abwicklung von OOS/OOT/OOE-Ereignissen (out of specification/trend/expectation), dem Mapping und der Überwachung der Stabilitätsklimaeinrichtungen sowie der Datenintegrität.

Wie schon bei der letzten FDA-Inspektion in 2009 wurden hierbei keinerlei Mängel festgestellt und keine „Inspectional Observation“ auf dem „form 483“ festgehalten. Mitarbeiter und Geschäftsleitung sind stolz auf dieses phanta­stische Ergebnis, denn dadurch wird erneut die hohe Qualität an diesem Standort und in den etablierten Prozessen durch die amerikanische Behörde bestätigt.

Auf Basis dieser ausgezeichneten Beurteilung durch die U.S. FDA ist die GBA Laborgruppe gerüstet, ihre Auftraggeber mit einem "one-shop" Service um­fassend zu beraten und mit dem breiten Dienstleistungsspektrum zu unter­stützen. Hierdurch können im analytischen und regulatorischen Bereich schnelle, flexible, innovative und kundenorientierte Lösungen angeboten werden.

Unter cGMP bietet Phytos GmbH & Co. KG wissenschaftlich-technische Lö­sungen bei der Entwicklung, Zulassung und Qualitätskontrolle auf allen Stufen des Produktlebenszyklus für seine Kunden aus Industrie und Forschung.

Profitieren Sie von unserem kompetenten Rundum-Service aus einer Hand, dessen ausgezeichnete und hervorragende Qualität nun bestätigt wurde!

Sollten Sie Fragen zu diesem Thema oder zu weiteren Themen unseres um­fangreichen Dienstleistungsportfolios haben, dann kontaktieren Sie bitte Ihren Ansprechpartner bei der GBA Laborgruppe oder

Phytos Labor für Analytik von Arzneimitteln GmbH & Co. KG
Herrn Stefan Woidich
Tel.: +49 (0) 731 974 39-0

 
 

Bestimmung von Ninhydrin-positiven Substanzen mittels eines Aminosäureanalysators (Ph. Eur. 2.2.56)

von Annette König und Dr. Bernd Larisch, GBA Laborgruppe

Die Bestimmung der „mit Ninhydrin nachweisbaren Substanzen“ ist eine zen­trale Prüfung in der Ph. Eur. für monographierte Aminosäuren.

In der Vergangenheit wurden diese Prüfungen gemäß der Vorgaben der Ein­zelmonographien der Aminosäuren mittels Dünnschicht-Chromatographie (DC) nach Ph. Eur. 2.2.27 durchgeführt. Dieses Verfahren wird jedoch sukzessive in allen Einzelmonographien der Ph. Eur. auf die wesentlich komplexere Prüfung mit Hilfe eines Aminosäureanalysators (Ph. Eur. 2.2.56) umgestellt.

Um eine Trennung der einzelnen Aminosäuren in einem Gemisch zu gewährlei­sten, werden pH-Wert, Fließgeschwindigkeit und Temperatur während der Chromatographie angepasst. Nach der chromatographischen Trennung über eine Ionenaustauscher-Säule bilden die einzelnen Aminosäuren während der Nachsäulen-Derivatisierung einen charakteristischen Farbkomplex mit Ninhy­drin. Das Derivat mit purpurner Färbung hat ein Absorptionsmaximum bei
570 nm, während Iminosäuren wie Prolin in ein Produkt mit gelber Färbung und einem Absorptionsmaximum bei 440 nm überführt werden. Diese Produkte können dann mittels eines photometrischen Verfahrens detektiert und das er­haltene Chromatogramm zur Auswertung der Prüfung verwendet werden. Die oft auch spezifizierte Verunreinigung durch Ammonium kann in der Regel dabei im selben Analysenlauf erfasst werden.

Seit Mai 2014 bietet die GBA Laborgruppe dieses Verfahren routinemäßig unter GMP-Bedingungen am Standort der LPU Labor für Pharma- und Umweltanaly­tik GmbH in Gräfelfing an.

Für die Prüfung auf Ninhydrin-positive Substanzen wurden hier für jede Amino­säure spezielle, verifizierte Methoden entwickelt, so dass die GBA Laborgruppe auch hier für Ihre Kunden unter den höchsten Qualitätsstandards arbeiten kann.

Sollten Sie Fragen zu diesem Thema oder zu weiteren Themen unseres um­fangreichen Dienstleistungsportfolios haben, dann kontaktieren Sie bitte Ihren Ansprechpartner bei der GBA Laborgruppe oder

LPU Labor für Pharma- und Umweltanalytik GmbH
Frau Annette König oder Herrn Dr. Bernd Larisch
Tel.: +49 (0) 89 858967-0

 
 

Charakterisierung von Biopharmaceuticals mittels massenspektrometrischer Verfahren

von Dr. Matthias Plöscher, GBA Laborgruppe

Massenspektrometrische Analysen spielen eine immer größere Rolle in der Analytik von pharmazeutischen Wirkstoffen.[1] Nicht nur die Charakterisierung der Wirkstoffmoleküle selbst ist hierbei von Bedeutung, vor allem auch deren Abbauprodukte und Verunreinigungen. Mögliche Strukturvarianten können mit Hilfe der Massenspektrometrie qualitativ und quantitativ analysiert werden. Dies trifft nicht nur auf klassische small molecule Wirkstoffe zu, sondern in hohem Maße auch auf moderne biopharmazeutische Wirkstoffe wie thera­peutische Peptide und Proteine sowie Antikörper. Besonders monoklonale Antikörper sind hier von Bedeutung, da es sich hierbei um hochkomplexe Moleküle mit zahlrei­chen strukturellen Heterogenitäten handelt.

Die neuesten pharmazeutischen Entwicklungen gehen in die Richtung, Anti­körper mit hochwirksamen small molecule Wirkstoffen (z.B. Zytostatika) ko­valent zu koppeln und so diese zielgerichtet an ihren Wirkort zu transportieren. Diese Antikörper-Drug-Konjugate (ADC) stellen besondere Herausforderungen an die einzusetzenden analytischen Methoden, da nicht nur der Beladungszu­stand eines Antikörpers zu bestimmen ist, sondern auch die exakten Bindestel­len be­kannt sein sollten. Darüber hinaus kann die chemische Modifikation der Anti­körper weitere teils nicht erwünschte strukturelle Veränderungen erzeugen.

Hier bietet die hochauflösende Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometrie (Quadrupol-Time-of-Flight Mass Spectrometry, Q-TOF MS) beste Möglichkeiten einer umfangreichen strukturellen Aufklärung. Q-TOF Massenspektrometer werden üblicherweise an modernste U(H)PLC-Systeme (ultra-high performance liquid chromatography) gekoppelt, wodurch eine schnelle chromatographische Trennung der Analyten erreicht wird. Mittels Elektrospray-Ionisierung (ESI) werden diese elektrisch geladen und anschließend in das Hochvakuum des Massenspektrometers transferiert. Im MS-Modus kann so eine hochauflösende Massenbestimmung vorgenommen werden, wobei gerade Q-TOF Systeme den Vorteil eines sehr großen detektierbaren Massenbereichs aufweisen. So können in einer Messung kleine Moleküle mit Massen von wenigen hundert Dalton (= atomare Masseneinheit [Da]) bis zu intakten Antikörpern mit einem Molekulargewicht von ca. 150 kDa detektiert werden. Schwere Moleküle im kDa-Bereich weisen hierbei eine hohe Anzahl an Ladungen pro Molekül auf. Primär gemessen wird in einem Massenspektrum das Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z-Wert). Das eigentliche Molekulargewicht wird daraus berechnet. Der so ermittelte Wert lässt bereits zahlreiche Rückschlüsse auf die Struktur des Antikörpers zu.

Weitere detaillierte strukturelle Aufklärungen werden üblicherweise durch eine Analyse von Peptiden des Antikörpers vorgenommen. Hierzu wird ein enzyma­tischer Verdau durch hochspezifische Enzyme, wie Trypsin oder LysC, vorge­nommen, welche hochspezifische Schnittstellen in der Aminosäuresequenz des Antikörpers erkennen und schneiden. Das hieraus resultierende Gemisch an Peptiden wird mittels RP-U(H)PLC (rapid and sensitive reversed phase) aufge­trennt und man erhält eine sogenannte Peptide Map, welche für jeden Antikör­per ein typisches Muster aufweist. Mit Hilfe von Q-TOF Massenspektrometern kann man nicht nur die Massen der Peptide bestimmen (Peptide Mass Finger­print), sondern durch Fragmentierung der einzelnen Peptide ebenfalls die exakte Aminosäuresequenz.

Der Unterschied von erwarteten zu beobachteten Fragmentierungen lässt Rückschlüsse auf chemische Modifikationen an den Aminosäuren zu. So können verschiedene Modifikationen wie beispielsweise die Oxidation der Aminosäure Methionin oder die Deamidierungsreaktion der Aminosäure Asparagin zu Asparaginsäure/Isoasparaginsäure exakt lokalisiert werden. Basierend auf der Signalintensität besteht darüber hinaus auch die Möglichkeit einer quantitativen Abschätzung des Anteils an modifizierten Strukturen.

In der Guideline ICH Q6B sind solche umfangreichen Charakterisierungen der strukturellen und physikochemischen Eigenschaften von proteinogenen Wirk­stoffen bereits vorgegeben.[2] Danach müssen neue Wirkstoffe bereits während der Entwicklung umfangreich strukturell charakterisiert werden. Entsprechend analysiertes Referenzmaterial muss zur Verfügung stehen, um den Wirkstoff in klinischen Phasen zu testen und einen Zulassungsantrag einreichen zu können.

Die GBA Laborgruppe bietet an dem Standort LPU Labor für Pharma- und Umweltanalytik GmbH in Martinsried entsprechende Analysen mit einem modernen Q-TOF Massenspektrometer an. Sollten Sie Fragen zu diesem Thema oder zu anderen Analysen oder Serviceleistungen der GBA Labor­gruppe haben, dann kontaktieren Sie bitte Ihren Ansprechpartner oder

LPU Labor für Pharma- und Umweltanalytik GmbH
Herrn Dr. Franz Menzinger
Tel.: +49 (0) 89 899 229 - 0



Literatur:
[1] Massenspektrometrie: Ein Lehrbuch, Jürgen H. Gross, Springer Spektrum
Verlag 2013
[2]
www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/
2009/09/WC500002824.pdf
, Stand 19.02.2016

 
 

Alternative für die Ph. Eur. Plattenguss Methode zum Nachweis der mikrobiellen Belastung in nicht-sterilen pharmazeutischen Zubereitungen

von A. Palicz, A. Paul, A. Hofmann (alle GBA Laborgruppe) und K. Denzel

Am pharmazeutischen Standort der GBA Laborgruppe in Neu-Ulm (Phytos Labor für die Analytik von Arzneimitteln GmbH & Co. KG) wurde für die Be­stimmung der Keimzahl die SimPlate Methode weiterentwickelt und validiert, um eine mögliche mikrobielle Belastung in nicht-sterilen pharmazeutischen Zuberei­tungen (Mycobacterium phlei e volumine cellulae Präparate) nach Europä­ischem Arzneibuch (Ph. Eur.) zu erfassen. Dieses Verfahren gewähr­leistet nicht nur den Vorteil, schneller zu sein, sondern auch weniger Proben­material zu be­nötigen.

Die Ergebnisse der Validierung belegen, dass das Detektionsvermögen der SimPlate Methode im Vergleich zu der Plattenguss Methode des Europäischen Arzneibuchs sich in einem ähnlichen (zwischen 1 und über 106 Zellen) oder besseren Bereich befindet. Die Resultate ergaben, dass die SimPlate Methode im Vergleich zur Plattenguss Methode ausreichend genau, spezifisch, linear, wiederholbar und robust für die Bestimmung der Gesamtkeimzahl (TAMC, z. B. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) und der Hefen und Schim­mel (TYMC, z. B. Candida albicans, Aspergillus brasiliensis) in den Lösungen waren. Sie kann als Ersatz zu der Plattenguss Methode des Arzneibuchs für die Bestimmung von TAMC und TYMC in nicht-sterilen pharmazeutischen Zuberei­tungen herangezogen werden. Bei der produktspezifischen Eignungsprüfung konnten mit einer 1:100 Verdünnung für Mycobacterium phlei e volumine cellu­lae Extrakte in NaCl-Pepton Puffer vergleichbare Resultate zwischen der SimPlate Methode und der Plattenguss Methode für den Nach­weis von TAMC und TYMC mit einer Nachweisgrenze von 100 KBE/g erzielt werden. Die opti­malen Bebrütungszeiten lagen bei 24-28 h für TAMC sowie bei drei Tagen für TYMC. Die Keimzahl in Lösungen mit und ohne Mycobacterium phlei e volu­mine cellulae Präparaten unterschied sich um einen maximalen Fak­tor von 2 und liegt damit in Übereinstimmung mit den Anforderungen des Euro­päischen Arzneibuchs. Im Vergleich zur Plattenguss Methode des Arzneibuchs war die Wiederfindung von Mikroorganismen mit der SimPlate Methode mei­stens höher (um Faktor 1-3) und niemals geringer. Die ausgewählte Methode für die Bestim­mung der Keimzahl war geeignet, mögliche mikrobielle Belast­ungen in Myco­bacterium phlei e volumine cellulae Präparaten zu detektieren und zeigte eine gute Übereinstimmung mit der Plattenguss Methode des Euro­päischen Arznei­buchs. Anhand des positiven Ergebnisses konnte demonstriert werden, dass die SimPlate Methode für die Bestimmung möglicher mikrobieller Belastungen in nicht-sterilen pharmazeutischen Zubereitungen geeignet ist.

Durch die Mitarbeit der GBA Laborgruppe in unterschiedlichsten Verbänden und Normenausschüssen sowie eigene Methodenentwicklungen versuchen wir für Sie stets auf dem aktuellen Stand der Entwicklungen und Fragestellungen zu sein. Den vollständigen Artikel zu der hier vorgestellten Methode finden Sie hier.

Sollten Sie Fragen zu diesem Thema oder zu weiteren Themen unseres um­fangreichen Dienstleistungsportfolios haben, dann kontaktieren Sie bitte Ihren Ansprechpartner bei der GBA Laborgruppe oder

Phytos Labor für Analytik von Arzneimitteln GmbH & Co. KG
Herrn Stefan Woidich
Tel.: +49 (0) 731 974 39-0

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